乳酸钠在延迟袋装鸡肉食品中肉毒杆菌产生肉毒素的作用

　　摘要:将添加1.4%氯化钠、0.3%磷酸钠和0（对照）、2.0、2.5、3.0、3.5%乳酸钠的生鸡肉接种10种混合型的（包括蛋白水解型A和B）肉毒杆菌孢子，然后粉碎，装入真空袋中。放入温度为88℃的水浴中，使肉的内部温度达到71℃。将上述处理后的袋装鸡肉放置于27℃的恒温箱中10天，以5袋为一个实验单位，每间隔一段时间后检测实验组中的肉毒素。随着乳酸钠浓度的上升，肉毒杆菌被抑制的效果也非常明显。 实验组中含有0、2.0、2.5、3.0和3.5%的乳酸钠时，肉毒素产生的时间分别是27℃静止放置后的第3、4-5、4-6、7、7-8天。肉汤培养实验揭示，延缓肉毒杆菌产生肉毒素的是乳酸根，而非钠离子。

　　一、引言

　　目前，市场上流通的熟食鸡肉制品一般都是真空包装，经过高温处理后，以细胞形态存在的微生物基本上都已被杀死，但是以孢子形式存在的微生物则能存活下来[1]。真空包装的鸡肉制品含有丰富的营养成分、较低的含盐量、接近中性的pH值和无氧条件，所有这些为肉毒杆菌的生长和肉毒素的产生提供了一个非常有利的环境[2]。低温成为抑制肉毒杆菌的生长和肉毒素的产生唯一手段。

　　亚硝酸钠被用来控制真空熟食鸡肉中肉毒杆菌的生长和肉毒素的产生[3]，但是，因为亚硝酸钠具有较高的致癌性，所以在熟鸡肉食品中亚硝酸钠的大量使用，遭到越来越多的消费者的抵制[4]。

　　过去很少有文献报导乳酸盐具有杀菌活性，1997年，Krol报导称[5]，在火腿中加入乳酸钠能抑制火腿中微生物的生长。本论文主要研究乳酸钠添加到真空袋装鸡肉制品中，常温下是否能抑制肉毒杆菌的生长及肉毒素的产生。

　　二、材料和方法

　　2.1 鸡肉接种：

　　将肉毒杆菌孢子接种到小块鸡肉上，而非较大的鸡块，这样可以保证肉毒杆菌孢子能均匀的分布到鸡肉中，然后将接种后的鸡块粉碎成直径为0.32cm的肉块。

　　将粉碎后的鸡肉分成5组，加入氯化钠、磷酸钠和乳酸钠，5组均含1.4%氯化钠、0.3%磷酸钠，分别含有0（对照）、2.0、2.5、3.0、3.5%乳酸钠。对于每个实验组，按分析化学中的方法，测定鸡肉中水分、蛋白质、脂肪、氯化钠、乳酸钠的含量和pH值[6]。

　　接种的肉毒杆菌孢子是A型的五株（52、62、69、77和90）和B型的五株（53、113、213、13983和Lamanna-okra）的混合型，每个真空袋内放入225g鸡肉，注入的混合型肉毒杆菌孢子数不少于500个/袋。

　　将包装好的真空袋放入88℃的水浴中，当真空袋中鸡肉内部的温度达到71℃后，取出并放入冰水中1个小时。这样操作的目的是煮熟鸡肉并使肉毒杆菌孢子处于休眠状态。冷却后的实验组，每个组取出两袋，用平板计数法计数孢子数量 [7]。

　　冷却后的袋装鸡肉放入27℃的恒温箱中，0-10天内，每隔一段时间，每个实验组每次取出5袋样品检测肉毒素。首先挑出产生气体的样品做检测，而没有产生气体的样品则采用随机抽检的方法。将整个真空袋中的鸡肉取出后放到烧杯中，加入等量的磷酸缓冲液（pH值6.2），浸泡2分钟， 然后用纱布当滤网过滤，用烧杯收集滤液。将收集到的滤液转移到离心管中，放入离心机，5000×g 离心5分钟。分离收集上清液并检测肉毒素。

　　取上清液0.5ml，注射到小鼠的腹腔内。接下来的四天内，观察小鼠的中毒症状。一旦有小鼠出现死亡现象，立即挑出两只有中毒症状的小鼠，注射抗毒素（A、B和E型混合物、37℃孵化30min）。作为对照，再取两只小白鼠注射上清液。假如注射抗毒素的小鼠没有死亡而没有注射抗毒素的小鼠发生死亡，则可以确认是肉毒素致小鼠死亡的。

　　以上操作重复三次，以检测添加乳酸钠的袋装鸡肉中肉毒素的情况。

　　2.2 肉汤接种培养实验：

　　为了确认是乳酸根还是钠离子，或者是二者共同作用抑制肉毒杆菌产生肉毒素，不同浓度的氯化钠和乳酸钠加入到七组梭菌属培养基中（0.3%酵母提取物、1.0%牛肉膏、1.0%蛋白胨、0.5%甘露糖、0.1%可溶解性淀粉、0.3%醋酸钾、0.05%半胱氨酸），这七组培养基含氯化钠和乳酸钠的量不同（如表1）

　　表1.　梭菌属培养基中乳酸钠和氯化钠含量　 

　　a 离子强度=1/2×(钠盐+氯化物+乳酸盐)

　　b 盐含量= 氯化钠百分数/(水分百分数+氯化钠百分数)

　　c 认为是培养基中钠盐含量

　　将培养基放到玻璃试管内，每个试管内放入量为25ml，每个试管接种上述混合型肉毒杆菌，80℃水浴15min，使肉毒杆菌孢子休克，然后放置于27℃的恒温培养箱内。在放置0、2、4、6、8、10和12天后，每组每次取五只试管做毒理实验（以小白鼠做实验）。放入培养箱之前，取三只试管以平板计数的方法测定肉毒杆菌孢子的数量，重复两次，测定孢子的平均数量为28-160个/ml。

　　三、结果和讨论

　　3.1 鸡肉接种实验：

　　三次测试结果非常相似（如表2），随着乳酸钠的含量从2%升到3.5%，肉毒杆菌产生肉毒素的时间在延迟。放置在27℃恒温箱中不含乳酸钠的袋装鸡肉，在第三天时被检测到肉毒素的存在；含有2.0%乳酸钠的袋装鸡肉在第4-5天时被检测到肉毒素的存在；含有2.5%乳酸钠的袋装鸡肉在第4-5天时被检测到肉毒素的存在；含有3.0%乳酸钠的袋装鸡肉在第7天时被检测到肉毒素的存在；含有3.5%乳酸钠的袋装鸡肉在第7-8天时被检测到肉毒素的存在。当鸡肉中添加3.0%的乳酸钠时，人的味觉是感知不到乳酸钠的存在的，但是，当乳酸钠含量达到3.5%时，人的味觉就能感知到乳酸钠的存在（数据未显示）。

　　表2 在袋装肉食品中添加不同浓度的乳酸钠条件下肉毒杆菌产生毒素的影响

　　a: 检测到毒素的样品数量／检测数量。测试1、2、3组中平均含肉毒杆菌孢子数分别是17个/g、1.2个/g、23个/g

　　b: — 没有测定

　　袋装鸡肉的化学成分如表3，数据是三次重复的平均值，实验中的鸡肉成分、盐含量、pH等

　　与市场上流通的产品基本一致。

　　表3 袋装鸡肉的化学成分

　　实验中的各个步骤都尽可能的与市场上流通的产品相似。主要有两点与市场上流通的产品有所差别，其一是接种孢子的数量是2.2-23个/g，而实际生产中，鸡肉中含有的肉毒杆菌孢子数要远低于这个数，因为自然界中存在的肉毒杆菌孢子的数量非常低。在市场上流通的产品中[8]，含有肉毒杆菌孢子数为0.00004-0.00167个/g（1，2，4,8），Skjelkvale研究结果显示[9]，煮熟后的肉制品中不含肉毒杆菌，只有很少量的嗜温梭菌。

　　其二是接种的肉毒杆菌孢子，以及添加的乳酸钠和氯化钠与鸡肉是充分混匀的，而实际生产中是将氯化钠、磷酸钠和乳酸钠配置成溶液，然后注入到鸡肉中。这种偏差会使得实验结果与实际生产中的情况有轻微的变化，但乳酸钠在这种实验环境下所起到的抑制肉毒杆菌产生肉毒素的作用，与实际生产环境下的作用应该是一样的。

　　3.2 肉汤接种实验：

　　结果显示是乳酸根在抑制肉毒杆菌产生肉毒素，而非钠离子（表4）。5、6、7这三个实验组中，含有相同浓度的钠离子（1.14℅）和相同的离子强度（0.51），但是氯化钠的含量分别是2.50、1.25、0.00℅，乳酸钠的含量分别是0.00、2.40、4.80℅。很明显是乳酸根含量在延迟肉毒杆菌产生肉毒素，而非钠离子含量、离子强度或者盐含量。乳酸根浓度越大，毒素被延迟产生的时间愈长，与在鸡肉中的实验结果相似。要起到延迟肉毒素产生的作用，乳酸根需要有一个最低浓度，从实验组4中可以看出这一最小浓度是乳酸钠含量介于1.92℅和2.40℅之间，因为，当乳酸钠含量为1.92℅时，不能延迟肉毒素的产生。

　　表4培养基中添加不同浓度的氯化钠和乳酸钠后肉毒杆菌产生毒素情况

　　a: 每次处理按表1的做法

　　b: 检测到毒素的样品数量／检测数量。测试1、2组中平均含肉毒杆菌孢子数分别是28个/ml、160个/ml

　　从表4中的实验结果可以看出，当肉汤培养基中乳酸钠浓度相同时，毒素检测结果亦有差别，这种差别可能是因为培养基的PH值不同引起的，在实验组1中，pH值为5.8-6.0，而实验组2中pH值为6.2-6.5。因此，乳酸根在pH值比较低的时候杀菌活性较大，这主要是因为当pH值较低时，未解离的乳酸含量较多。

　　3.3 讨论

　　尽管乳酸根抑制肉毒杆菌产生肉毒素的具体机制还不清楚，但我们推测可能存在两种机制，一是高浓度乳酸根离子的存在，对细胞内丙酮酸的生成产生反馈抑制作用，导致生成的丙酮酸量减少，而丙酮酸是厌氧菌生长繁殖必不可少的能量来源；二是肉毒杆菌从细胞内部清除出乳酸根离子，必须要消耗大量的ATP，而ATP的减少，直接抑制了乳酸杆菌的生长繁殖，这种机制类似于乳酸对乳酸链球菌的影响[10]。

　　以上这些结果显示，乳酸钠具有延迟肉毒杆菌产生肉毒素的作用，这种作用依赖于乳酸钠的浓度。

　　（文/刘国祥，申介健，于培星，张红丽，孙自华）